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治疗癌症、灭绝蚊子、复活猛犸象……最近流行的 CRISPR 基因技术到底能做什么,进展如何?

好奇心日报 2017/9/7 16:31:29
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三分钟知道 CRISPR 是怎么回事

基因编辑存在已久,其实传统的杂交育种就是早期对基因的人工改造,比如袁隆平 1977 培育出穗大粒多的“南优 2 号”杂交水稻。更早的还有宠物狗,很多品种都是通过杂交诞生的。你也可以认为这是一种基因编辑。但无论是水稻还是杂交狗,由于没有借助现代分子生物学的手段,无法精细地修饰基因,结果非常不可控。

而 1980 年开始兴起的转基因能够做到这一点。将目的基因与载体分子结合为重组 DNA 分子,利用农杆菌或基因枪注入到受体细胞后大量增殖,再筛选出具有重组 DNA 分子的重组细胞,以此导入外来的基因。这种方法用比较粗糙的方法以外部片段修饰目标基因,比较随机,也不够准确。

CRISPR 则可以做到精确编辑任何生物、任何细胞里的 DNA。CRISPR 是一个缩略词,指的是细菌细胞中“规律成簇的间隔短回文重复”(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)。简单地说,它是一个 DNA 序列,是一段基因记忆,是细菌在长年对抗病毒入侵时积累的血肉长城,重复的序列就是蜿蜒的城墙。就像人体的免疫系统,能够提取入侵细菌或病毒的特征,并呈递给免疫细胞让它形成记忆,从而当病原二次入侵时能及时识别消灭。

细菌在世世代代与病毒的抗争之中,也进化出了这种简易而精确的免疫功能。过往的病毒将基因重复遗留在细菌的 DNA 链上,形成细菌的“记忆”,在病毒再次入侵时,指引酶等工具来消灭它。具体来说,病毒感染细菌时,会把自己的遗传物质嵌入到宿主细胞的 DNA 上,深入内部反客为主,利用宿主细胞为自己服务。细菌则进化出了 CRISPR 这一免疫武器,它是之前的病毒感染痕迹的留存,也是病毒基因特征的记录。等到病毒再次入侵并嵌入基因时,CRISPR 就能凭借此前的记录,引导相关的蛋白(CRISPR associated,Cas)把外来的基因切除掉,从而解决掉入侵的病毒。

科学家们利用了 CRISPR 精准切割的这个特性,对它重新编程,使之能切割任何生物的任何 DNA,达到人为编辑基因的目的,以改变生物原有的遗传特性、获得新性状。在 CRISPR 之前,学术界广泛应用的是基因打靶、锌指核酸内切酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN),它们都是与转录因子相关的核酸酶。比起它们,CRISPR 技术成本低廉、操作方便、效率高、可以同时编辑不同的位点,一次顶过去五次。

以应用最广泛的 CRISPR / Cas9 为例,想象基因是由很多节点构成两条双螺旋的链条,而编辑只需要用到两个工具——向导 RNA(guide RNA, gRNA)和 Cas9 蛋白。

 


将 DNA 链精确地剪开,以达到增添或敲除的目的,示意动画来自 MIT

 

Cas9 蛋白像一把剪刀,通常从基因节点,也被称为碱基 NGG (N 代表任意碱基)的地方剪断基因。

随后,人工设计的向导 RNA 会将 DNA 双螺旋解开,配对到其中一条,Cas9 蛋白再出手在刀口处剪断。随后 DNA 会开启自动修复机制,将剪断的两端连接起来,从而实现目标区域的敲除或替换。

虽然操作和效率都得到了提升,但 CRISPR 技术可能存在的问题就是,向导 RNA 不一定每次都能准确匹配被剪短的基因。在 DNA 损伤修复的时候也可能出现意外。就像是一列没有被铁轨合理引导的出轨火车,随时会导致基因组产生未知的突变,这被称为脱靶效应。

随着科学家们对 CRISPR / Cas 系统的不断优化,脱靶率正在不断降低。


把照片存进了 DNA


用 CRISPR 技术编辑基因需要几步?答案是三步:确定目标基因,找到目标片段,接下来就开始剪。示意动画来自《麻省理工科技评论》

 

使用 DNA 存储数据并不是资讯,5 年前就有团队在 DNA 中存储文字和图片。作为新兴的存储介质,它存储密度巨大,1 克 DNA 可存数亿 GB 数据;储存年限久远,妥善保存可数万年,并且测序就能读取。缺点则是目前合成 DNA 的成本太高,且不能随时存取。

但在此前的研究中,存储的介质都是人工合成 DNA 的片段,而不是活细胞中的 DNA。研究团队这次把一张手掌的照片和一段策马奔腾的动态图片编码成 DNA 片段,借助 CRISPR 技术剪切到大肠杆菌的基因当中,在数代繁衍后重新读取 DNA 片段,图像的还原度达到了 90%。



这张图来自摄影师 Eadweard Muybridge 的动态摄影,GOOGLE用这张图做过 Doodle。图片来自 Seth Shipman


论文的编辑之一、哈佛医学院合成生物学家 Seth Shipman 想要研究大脑发育的过程,这个过程中会有一系列生化反应在细胞中发生,但很难明确地记录下来。而这项研究证明了 CRISPR 技术在大肠杆菌上的应用,真正的目标是让细胞变成记录仪,可以收集各种分子信息并存储在 DNA 当中,以便之后查阅在发育中的作用。这个概念被称为“分子纸条”,正是 George Church 的点子。

合成生物学的另一个课题是人造生命体。科学家们一直在研究怎样才能人工合成细胞——按照人为编码,细胞可以按需合成出各种各样的药物。美国遗传学家 Craig Venter 在 2010 年将合成的基因组引入去掉基因的宿主细胞,结果是宿主可以连续复制。

来自 Scripps 研究所的团队则分别在 2014 年和今年创造了半合成的生物体,今年他们利用 CRISPR-Cas9 技术强化了三年前的版本,去掉了排斥非天然碱基的基因,这将允许他们在合成 DNA 中任意添加想要的基因片段,这为蛋白质的按需定制奠定了基础。


糖尿病、癌症治疗已经在日程上,但大多在非常早期


将缺陷得到修饰的细胞输回体内,或着修复代谢失衡,或着加强免疫细胞的攻击力,从而起到治疗的作用。示意动画来自《麻省理工科技评论》


理论上,只要找到和疾病相关的基因,用 CRISPR-Cas9 编辑去掉致病的因素,就可以治疗基因缺陷方面的疾病。科学家们凭此展开了各种各样的设想与尝试。最有希翼的应用是单基因疾病的治疗,如囊性纤维化、镰状细胞性贫血和肌营养不良症。它看上去挑战最小:修改人类基因组 30 亿基因片段里的 1 段。

例如,镰状细胞性贫血是由血红蛋白基因缺陷引起的,一个氨基酸的差异导致正常的血红蛋白无法形成。一个设想是,利用 CRISPR 技术将抽出的血液编辑基因,再重新输回身体,就能产生正常的血红蛋白。但这种做法也不是一劳永逸,镰状细胞基因已知可以预防疟疾,如果切掉了这段基因就失去了天然的防护。为此,张锋创立、获得盖茨基金会投资的 Editas 企业正在解决这个问题。

类似的,如果能够去掉编码疾病相关蛋白的基因,就能中止致病蛋白的合成。已经展开的研究有舞蹈病、帕金森和渐冻症等。糖尿病的潜在治疗策略也类似,对 2 型糖尿病,去年隆德大学的一项研究关掉了大鼠体内组蛋白乙酰转移酶的合成,从而增加胰岛素的产生。

1 型糖尿病的策略脑洞更大,今年 8 月芝加哥大学的一项研究中,研究人员把基因编辑后的表皮干细胞贴在小鼠的皮肤上,然后大量喂食,人造皮肤分泌的激素 GLP-1 会促进胰岛素的分泌,从而免去了肥胖小鼠自己打胰岛素的烦恼。

癌细胞的应对策略也类似。去年 6 月,宾夕法尼亚大学改造 T 细胞并灌注回患者体内,让它能靶向攻击骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤,并申请了人体实验。还有一些研究则瞄准了癌细胞的弱点,利用 CRISPR 快速诊断并切掉癌症突变,并用来完善个体化疗法。

除了修复内在的缺陷,CRISPR 技术还可以应对外来的威胁。切掉逆转录病毒的遗传物质,如乙肝病毒、艾滋病病毒等。逆转录病毒感染细胞时,会将自己的遗传片段整合进宿主的 DNA,再利用宿主细胞复制繁衍。因为它们藏匿在细胞核中,目前通常只能用药物抑制它的复制,让它的遗传片段保持休眠。

基因编辑技术则让人看到了将它从基因中切掉的曙光。已经有多个研究团队设计出了靶向乙肝病毒基因片段的向导 RNA,并在细胞培养和小鼠身上做了测试,实验均表明乙肝病毒的复制和藏匿都受到了破坏,是根除乙肝有潜力的治疗方法。

艾滋病方面的研究也有诸多突破。有的团队用这项技术改造免疫防线 T 细胞,去掉了 T 细胞表面结合 HIV 的 CCR5 受体,想让病毒走投无路,无法进入 T 细胞破坏免疫系统,从而获取对它的免疫力;有的团队利用它切除在细胞核中藏匿的 HIV 基因片段,最新的进展是,5 月的一项研究称,天普大学和匹兹堡大学的研究人员第一次在活体动物的基因组中清除了 HIV 的 DNA,从而将它在小鼠体内彻底消灭。这意味着这种治疗策略具有清除藏匿 DNA 的潜力,团队正计划在灵长类动物中重复这一研究。

CRISPR 技术还有可能解决器官移植的问题。本月《科学》上的一项研究为这种方案提供了可能性,一家名为 eGenesis 的企业利用这项技术,剪去了猪身上的病毒基因,从而消除了猪器官中很大的安全隐患,为此后的移植奠定了基础。

只不过,以上提到的研究都处于非常基础的阶段,在体外细胞和小鼠中有效并不意味着这些疾病从此有药可医,中途还需要经过漫长的重复验证和三期临床试验。

这些研究中,进展比较快的已经开始了临床试验。其中最早的是去年 10 月四川大学华西医学院肿瘤学家卢铀在晚期非小细胞肺癌患者身上的实验,10 名患者接受了编辑过的免疫细胞的注射。团队希翼,对于化疗、放疗和其它手段均无效的患者,敲除 PD-1 基因的免疫细胞可以恢复对肿瘤细胞的攻击能力。目前实验还在进行当中。

4 月 28 日,南京大学魏嘉团队在鼓楼医院第二个开启了在鼻咽癌患者身上的人体实验。根据临床试验注册表,中国正计划多项敲除 PD-1 相关的癌症临床试验,包括乳腺癌,前列腺癌,膀胱癌,食管癌,肾癌,结肠直肠癌等。

宾夕法尼亚大学的研究团队也在做类似的工作,他们希翼招募到 18 名骨髓瘤、肉瘤和黑色素瘤的患者,并改造他们的免疫细胞,方法和卢铀团队相同。这个项目由 Sean Parker 赞助,也获得了美国国立卫生研究院的批准,如果能获得美国药监局的批准,临床试验有望于今年开始。

目前提到的这些治疗技术,除了中国正计划的多项癌症临床试验外,其它基本都还在非常早期阶段。


基因编辑后的食物可以不打“转基因”的标志

1946 年,科学家首次发现 DNA 可以在生物间转运。直接植入抗体基因让农作物自带抵抗害虫的转基因技术极大的提升了农作物的产量。问题在于人类长期使用添加了新增基因,是否会产生不良的影响?这种担忧让监管机构要求转基因食物必须明确标注是被基因改造过的。

美国生物科技企业 AquaBounty 培育出来的转基因三文鱼,被美国食品安全局 FDA 强制要求标注转基因才能销售。由于担心消费者对于转基因食物的担忧导致三文鱼卖不出去,AquaBounty 企业选择不在美国出售,只在加拿大出售三文鱼,在加拿大,转基因食物不用特别标注。



两条同样年龄的三文鱼。上方是 AquaBounty 的转基因三文鱼,下方是按照普通方法培养的三文鱼。


但如果不新增基因,只是删除掉不好的基因片段来改造农作物,这可能就不用标上转基因标示了。

无论在中餐还是西餐中,白蘑菇都是一道重要的食材。不过,白蘑菇最好是现买现做,如果在冰箱中放上两天,它就会变成褐色,并且黏糊糊的。实际上,白蘑菇褐变是由一种叫多酚氧化酶(PPO)引起的。于是,宾夕法尼亚大学教授杨亦农和他的团队利用 CRISPR 基因编辑技术,敲除了 6 个氧化酶编码基因中的 1 个,将酶活性降低了 30%,从而延缓白蘑菇褐变,好处显而易见,至少你可以在冰箱里多放几天白蘑菇。2016 年 4 月,美国农业部表示,它不会对 CRISPR 基因编辑过的白蘑菇进行监管。

关键就在于通过 CRISPR 这种能精确定位基因片段的技术来删除氧化酶编码基因片段,并不会使用来自病毒或细菌的外来基因,所以并不会对周围农作物产生任何可能的危害。

吃上这种白蘑菇可能还有段时间,虽然农业部明确表示不会监管由 CRISPR 基因编辑过的各种农作物,但美国食品安全局 FDA 还需要时间来确定是否能安全食用,以及是否需要像转基因食物那样明确标注出来。

但至少从原理上,仅仅是删除掉不良基因的食物可能更容易让监管部门接受。


为防止影片里的灾难,基因编辑也有“自杀开关”

被基因改造过的生物从实验室逃走引发一系列的灾难,是好莱坞影片最常见的情节之一。用技术改造基因会不会产生变异的生物,不仅仅是影片编剧的担忧,至少科学家已经在考虑如何控制基因编辑导致可能的危害。

为了预防实验室中被修改过基因的细菌“逃逸”。今年 2 月,麻省理工学院的研究人员利用 CRISPR 基因编辑开发了一种可以让细菌自我毁灭的“自杀片段”。细菌被植入了这种基因片段后,它将不得不依赖实验室中培育细菌的环境。一旦离开了实验室的环境,自杀基因片段就会被诱发,从而删除细菌内特定的基因,让细菌快速死亡。

在试验中,大肠杆菌被植入一种名为 DNAi 的系统,这个系统分为两块组成部分,一种是通过 CRISPR 技术编辑过,可以准确定位细菌核心基因的片段,和另一种会被阿拉伯糖分子诱发,负责切除核心基因的 Cas9 酶组成。

测试中,在大肠杆菌接触到阿拉伯糖分子仅仅 15 分钟之后,99 % 的细菌都被杀死。

对于麻省理工学院的生物教授克里斯托弗·沃格特(Christopher Voigt)来说,这种技术不单单意味着可以诱发离开实验室的细菌快速死亡,还可以保护一些机密研究成果不会被泄露。利用 CRISPR 基因编辑控制细菌存活可以实现的作用有很多,至少大家不用担心未来真的要面临影片情节那样的考验了。

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